Metot validasyonu terimi bir metodun kullanım amacına uygunluğunun objektif kriterler ile teyit edilmesi olarak tanımlanabilir. Gıda mikrobiyolojisinde metot validasyonu, genellikle analiz sürelerini kısaltmak amacı ile geliştirilen alternatif metotların referans metotlar ile eşdeğer olduğunun teyit edilmesidir. Gıdaların mikrobiyolojik analizlerine yönelik referans metotlar ulusal (TSE, NEN vs) ve uluslararası (ISO, IDF vs) organizasyonlar tarafından yayınlanan klasik kültürel metotlardır. Referans metot kavramı gıda mikrobiyolojisinde olduğu gibi analiz sonuçlarının doğrudan analitik prosedüre dayalı olduğu analizler için geçerlidir.

Gıda endüstrisinde analiz sonuçlarının hızlı elde edilmesi mikrobiyolojik gıda güvenliği risklerine karşı önlemlerin zamanında alınabilmesi için bir gerekliliktir. Bu nedenle immunoassay, impedimetre, flow sitometri, nükleik asit hibridizasyon ve biyolüminesans gibi klasik kültürel metotlardan farklı analitik prensiplere dayalı birçok  alternatif hızlı  metot  laboratuarların kullanımına sunulmuştur. Bu  alternatif metotların validasyonu üretici  firmaların  talebi  ve  finansmanı  ile  bağımsız  organizasyonlar  tarafından  (AOAC,  AFNOR,  MicroVal, NordVal vs) ilgili ISO standardı (ISO 16140) veya bu organizasyonlarca yayınlanan validasyon rehberlerine göre gerçekleştirilmektedir. Alternatif metotlar, kalitatif veya kantitatif olmalarına bağlı olarak farklı performans karakteristikleri ile değerlendirilirler.

ISO/IEC 17025 standardına göre gıda mikrobiyolojisi laboratuarları referans metotları veya validasyon çalışmaları gerçekleştirilmiş alternatif metotları tercih ettiklerinde yalnızca metodu uygulamada ki yeterliliğin değerlendirilmesine yönelik verifikasyon çalışmalarını gerçekleştirmekten sorumludurlar. Yani metot verifikasyonu metodun değil laboratuarın yeterliliğine yöneliktir. Bu nedenle sekonder validasyon veya kısıtlı validasyon olarak ta isimlendirilmektedir.

Kantitatif mikrobiyolojik metotların verifikasyonu amacıyla iki performans karakteristiği değerlendirilmelidir; doğruluk (Trueness) ve kesinlik (Precision). Elde edilen analiz sonuçlarının doğru kabul edilen değere yakınlığı olarak ifade edebileceğimiz doğruluk yeterlilik testlerinden elde edilen sonuçlar veya kontamine  edilen  örneklerden  elde  edilen  geri  kazanım  (Recovery)  değerleri  ile  değerlendirilebilir.  Aynı örnekten elde edilen analiz sonuçlarının birbirine yakınlığı olarak ifade edebileceğimiz kesinlik ise sabit veya farklı koşullar altında değerlendirilebilir. Koşulların (Analist, zaman, ekipman) sabit olduğu çalışma tekrarlanabilirlik (Repeatability), farklı olduğu çalışma ise laboratuvar içi tekrarüretilebilirlik (Intra-lab reproducibility) olarak isimlendirilir. Mikrobiyolojinin doğası gereği bu koşullardan zamanın değiştirilmesi mümkün değildir. Bu durumda personel ve mümkün olduğu sürece ekipman değişikliği ile laboratuvar içi tekrarüretilebilirlik şartları sağlanabilir.

ISO/TS 19036 standardı gıda mikrobiyolojisi analizlerinde laboratuar içi tekrarüretilebilirliğin değerlendirilmesi için pratik bir protokol tanımlamıştır. Aynı protokol ISO 5725-3 standardında laboratuar içi tekrarüretilebilirliğin değerlendirilmesi için alternatif yöntem olarak yer almaktadır. Bu protokolün kullanılması durumunda elde edilen standart sapma ölçüm belirsizliğinin hesaplanmasında kullanılabilir. Ölçüm belirsizliği, ölçülen büyüklüğün gerçek değerini içinde bulunduran değerler aralığını karakterize eden tahmini değer dir ve sayısal  bir   değer  olarak  yalnızca  kantitatif  analizler  için  geçerlidir.  Gıda  mikrobiyolojisi  laboratuarları verifikasyon ve kalite kontrol çalışmalarından elde edilmiş yeterli kesinlik verilerine sahip olmaları durumunda ölçüm belirsizliklerin yalnızca bu verileri kullanarak hesaplayabilirler. Mikrobiyolojik analizlerde birçok belirsizlik kaynağı için belirsizliğin hesaplanmasının mümkün olmaması nedeni ile GUM (ISO/IEC 98-3, Guide to the expression of uncertainty in measurement) prensiplerinin kullanılması mümkün değildir. Laboratuar içi tekrarüretilebilirlik çalışmasından elde edilen standart sapma muhtemel belirsizlik kaynaklarını kapsamasından dolayı birleştirilmiş belirsizlik olarak kabul edilebilir.

Kalitatif metotların verifikasyonu amacıyla hassasiyet (Sensitivity) değerlendirilmelidir ve bu amaçla düşük   düzeyde  kontamine  edilen   (Örneğin,   5-10   kob/25  g)   örnekler   kullanılmalıdır.  Poisson   dağılım prensibinden dolayı hedef kontaminasyon düzeyinin 5 kob/25 g’ ın altında olması durumunda analize aldığımız örnek hedef bakteriyi içermeyebilir. Bu durumda negatif sonuçların yorumlanması problem olacaktır.

Metot verifikasyonu ve iç/dış kalite kontrol birbirlerini tamamlayan kavramlardır. Bu nedenle bazı kaynaklarda iç ve dış kalite kontrol çalışmaları devam eden verifikasyon (On-going verification) olarak tanımlanmıştır. Gıda mikrobiyolojisi laboratuarları iç kalite kontrol amacıyla kantitatif analizler için doğruluk ve kesinliği, kalitatif analizler için ise hassasiyeti değerlendirmelidirler. Kantitatif analizler için doğruluk bir dış kalite kontrol yöntemi olan yeterlilik testleri ile değerlendirilmektedir. Bu nedenle kesinlik, kantitatif mikrobiyolojik analizlere yönelik iç kalite kontrol için bir zorunluluktur. Aynı örnekten elde edilen iki analiz sonucu arasındaki farkın belirlenen limit değerler ile karşılaştırılması kesinliğe yönelik en pratik iç kalite kontrol çalışması olacaktır. Kontrol örneği ISO/TS 19036 standardında tanımlanan protokole göre çalışıldığı takdirde limit değer olarak verifikasyon çalışmalarında elde edilen laboratuar içi tekrarüretilebilirlik limiti (SR×2,83) kullanılabilir. İç kalite kontrol çalışmaları sayesinde laboratuarlar gerektiğinde ölçüm belirsizliklerinin yeniden hesaplanması için her zaman güncel kesinlik verilerine sahip olacaklardır.

Bir laboratuarda metot ile verilen faktörlerde değişiklikler kaçınılmazdır. Bu değişiklere farklı marka besiyeri veya biyokimyasal kit kullanımı, klasik doğrulama testleri yerine biyokimyasal kit kullanımı, farklı marka veya model inkübatör kullanımı veya manual koloni sayımı yerine otomotize sistemlerin kullanılmasını örnek  verebiliriz. Bu  örneklere  daha  birçok  faktördeki  değişiklikleri  ilave  edebiliriz.  Metot faktörlerinde  her  bir  değişiklik  sonrasında  verifikasyon  çalışmalarının  tekrarı  gereklimidir ?   ISO/IEC 17025  standardının  teknik  şartlarına yönelik  prosedürlere sahip laboratuarlar  için  bu sorunun  cevabı hayır olacaktır  . Tüm bu faktörler için gerekli kontrol çalışmaları ISO/IEC 17025 standardında ve ilgili EA rehber dokümanında (04/10)  metot  verifikasyonundan farklı  başlıklar altında  tanımlanmıştır.  Akreditasyonun gereği  olarak  gıda mikrobiyolojisi laboratuarları besiyerleri, biyokimyasal kitler ve cihazlara yönelik kalite kontrol faaliyetleri ile bu faktörlerin uygunluğunu, iç ve dış kalite kontrol faaliyetleri ile bu  faktörlerdeki değişiklerin analiz sonuçlarına etkisini düzenli olarak değerlendirmelidirler. Kontrol programlarına sahip laboratuarlar için besiyeri, biyokimyasal kitler ve cihaz gibi metot faktörlerindeki  değişiklikler akreditasyon açısından engel  değildir  ve metot verifikasyon çalışmalarının tekrarını  gerektirmez .

Kaynaklar

AOAC INTERNATIONAL BPMM Task Force Final Report 8-7-06, 2006, Presidential task force on best practices for microbiological methodology.

EA 04/10, 2002, Accreditation for Microbiological Laboratories.

ISO 16140, 2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods.

ISO  5725-3,  1994,  Accuracy  (trueness  and  precision)  of  measurement  methods  and  results  -  Part  3: Intermediate measures of the precision of a standard measurement method.

ISO/IEC 17025, 2005, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.

ISO/TS  19036,  2006,  Microbiology  of  food  and  animal  feeding  stuffs  -  Guidelines  for  the  estimation  of measurement uncertainty for quantitative determinations.

RVA T2, 2006, Explanatory document on microbiology.