Gıdalarda Esherichia coli O157:H7
İzolasyonu ve İmmunomanyetik
Seperasyon

Ürettikleri toksinleri vero hücre kültürleri üzerine sitopatik etki göstermesi nedeni ile Esherichia coli O157:H7 serotipinin içinde bulunduğu E. coli serotipleri Verotoksijenik E. coli (VTEC) olarak isimlendirilmektedir. Bugün VTEC olarak tanımlanan 100’ ün üzerinde E. coli serotipi vardır. Ancak VTEC tanımı gıda patojeni olarak tanımlandığı 1982 yılından bu yana neden olduğu vaka ve ölüm sayıları nedeniyle E. coli O157:H7 ile özdeşleşmiştir. ABD’ de her yıl ortalama 70.000 kişi E. coli O157:H7 nedeni ile hastalanmaktadır. Bu vakalardan ortalama 60 tanesi ölümle sonuçlanmaktadır.

Yapılan çalışmalar E. coli O157:H7 vakalarının çoğunluğunun yetersiz ısıl işlem gören et ve süt ürünlerinden kaynaklandığı ortaya konmuştur. Bakteri hücrelerinin strese maruz kalsalar dahi patojenik özelliklerini koruyabilmeleri nedeni ile gıdalarda ısı, asit veya tuz gibi farklı streslere maruz kalmış E. coli O157:H7 hücrelerinin tespit edilmesi önem taşımaktadır. Bu durum gıdalarda E. coli O157:H7 izolasyonu için kullanılan besiyerlerinin zenginleştirici ve inhibe edici özelliklerinin dengelenmesini zorlaştırmaktadır. Çünkü besiyerlerine seçicilik sağlayan bileşenler hedef bakteri üzerine de baskılayıcı etki gösterebilmektedir.

Klasik kültürel metotlar ile gıdalarda E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan zenginleştirme ve izolasyon besiyerlerinin yeterli seçicilik sağlayamaması önemli bir problemdir. Kültürel metotlarda yer alan zenginleştirme besiyerlerinin başta Entero bacteriaceae türleri olmak üzere rekabetçi flora üzerine inhibisyon etkisinin sınırlı olması nedeni ile besiyerinde hedef mikroorganizmanın dışında birçok tür gelişebilmektedir. 

LAB M CaptivateTM O157 IMS sistemi

E. coli O157:H7 serotipi diğer E. coli serotiplerinin çoğunluğundan farklı olarak 24 saat içinde sorbitolü fermente edemez ve ß-D-glucorinidase negatiftir. Günümüzde gıdalardan E. coli O157:H7 izolasyonunda kullanılan referans besiyeri Sorbitol MacConkey agar (SMAC)’ dır. E. coli O157:H7 dışında bazı E. coli serotipleri ve Proteus türleri de sorbitolü fermente etme yeteneğine sahip olmadıklarından dolayı SMAC agar üzerinde E. coli O157:H7 ile benzer renksiz koloniler oluşturabilmektedirler. Bu durum identifikasyon aşamasındaki maliyeti ve iş yükünü arttırmaktadır. Bu nedenle referans metotlarda SMAC agar besiyerine E. coli O157 serogrubu dışındaki E. coli serogrupları ve Proteus türlerinin inhibisyonu için sefiksim ve tellürit (CT) ilavesi tanımlanmıştır. Bununla birlikte bazı E. coli O157:H7 serotiplerinin tellürite karşı hassasiyet gösterdikleri unutulmamalıdır. Bu nedenle CT-SMAC besiyerinden farklı ikinci bir izolasyon besiyeri kullanılması önemlidir. Gıdalarda E. coli O157:H7 aranmasına yönelik mevcut ISO metodunda (ISO 16654) ön zenginleştirme aşamasından sonra immunomanyetik seperasyon (IMS) aşaması yer almaktadır. İmmunomanyetik seperasyon ile zenginleştirme besiyerinde gelişen hedef mikroorganizmalar antikor kaplanmış manyetik partiküller ile antikor-antijen kompleksi sayesinde yakalanır. Bu yöntemle zenginleştirme besiyerinde gelişebilen ve izolasyon besiyerinde E. coli O157:H7 kolonilerini maskeleyebilecek veya benzer koloni oluşturabilecek türler ve E. coli O157 dışındaki E. coli serogrupları elimine edilebilir. Yapılan çalışmalar gıdalarda E. coli O157:H7 aranmasında IMS tekniğinin kullanımının doğrudan  izolasyon besiyerine inokülasyona nazaran daha hassas olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca IMS kullanıldığı takdirde 6 saatlik bir ön zenginleştirme yeterli olmaktadır. Böylece IMS aşaması hassasiyeti arttırırken analiz süresini azaltmaktadır.

LAB M CaptivateTM partikülü

CaptivateTM O157, LAB M tarafından gıdalardan  E. coli O157:H7 izolasyonu amacıyla geliştirilmiş, yüksek saflıkta ve spesifik antikorlar ile kaplanmış  mikroskobik  manyetik partiküllerin kullanıldığı bir IMS sistemidir. Ortalama büyüklükleri 2,5 µm olan partiküller bir manyetik çekirdeği saran seramik zirkonyum oksit katmanından oluşmaktadır. Captivate O157 uygulaması, zenginleştirme besiyeri ve Captivate partiküllerinin karıştırılması, antijen-antikor bağlanmalarının gerçekleşmesi için oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyon ve manyetik seperasyon standı kullanılarak tamponlanmış yıkama çözeltisi ile besiyeri kalıntıları ve hedef dışı mikroorganizmaların uzaklaştırılması amacıyla tekrarlı yıkama aşamalarını içermektedir.

E. coli O157:H7 düşük infektif dozu ve yüksek ölüm oranı ile seyreden kanlı ishal ve hemolitik üremik sendroma neden olmasından dolayı önemli bir gıda patojenidir. Bu nedenle E. coli O157:H7 analizinde gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarının elde ettiği yanlış negatif sonuçlar halk sağlığı açısından kayda değer risk oluşturmaktadır. Kullanılan metodun spesifikliği ve hassasiyetinin düşüklüğü yanlış negatif sonuç riskini artırmaktadır. CaptivateTM O157 IMS sisteminin klasik kültürel metotlar ile kullanımı daha spesifik ve hassas sonuçların elde edilmesinde gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarına önemli avantaj sağlamaktadır.

Doç. Dr. Emrah TORLAK
Konya Üniversitesi Fen Fakültesi